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觀察溫腎健脾法對腹瀉型腸易激綜合征大鼠內(nèi)臟敏感性及曠場實驗的影響
點擊次數(shù):2138 更新時間:2019-10-25

溫腎健脾法對腹瀉型腸易激綜合征大鼠內(nèi)臟敏感性和曠場實驗的影響

【摘要】 目的 觀察溫腎健脾法對腹瀉型腸易激綜合征( IBS) 模型大鼠內(nèi)臟敏感性及曠場實驗的影響。方法 28 只乳鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、溫腎健脾方組、匹維溴銨組 4 組,每組 7 只。模型組、溫腎健脾方組及匹維溴銨組乳鼠自出生第 2 天 ~ 第 21 天每天與母鼠分離 3 h,正常組不予干預(yù)。第 22 天斷奶,予常規(guī)自由飲食。第30 天起模型組、腎健脾方組及匹維溴銨組予以番瀉葉水煎液灌胃,同時溫腎健脾方組和匹維溴銨組分別以溫腎健脾方溶液和匹維溴銨片混懸液灌胃。正常組、模型組以相同劑量生理鹽水灌胃,連續(xù) 4 周。觀察各組大鼠腹壁撤退反射評分( AWR 評分) 及曠場試驗結(jié)果。結(jié)果 溫腎健脾方和匹維溴銨治療可以顯著降低腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠 AWR 評分,緩解其內(nèi)臟敏感性,顯著緩解大鼠精神萎靡,提高其活躍性。結(jié)論 溫腎健脾方可有效改善腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠的內(nèi)臟敏感性及焦慮抑郁樣行為。

 

腸易激綜合征( Irritable bowel syndrome,IBS) 是臨床上常見的一種功能性腸道疾病,常以腹痛、腹

瀉、便秘等為主要臨床表現(xiàn)[1 - 2]。我國發(fā)病率約為1% ~ 16%[3]。腹瀉型腸易激綜合征 ( Diarrhea -predominant irritable bowel syndrome,IBS - D) 是 IBS常見的亞型,占 IBS 23. 3% ~ 65. 0%[4],以反復(fù)腹瀉、腹痛發(fā)作為主要臨床表現(xiàn),常伴焦慮、抑郁等精神心理異常[5]。研究發(fā)現(xiàn),IBS 發(fā)病多與胃腸道動力異常以及內(nèi)臟感覺高敏感性有關(guān)[6]。魏瑋教授臨床用溫腎健脾法治療 IBS - D 患者臨床療效甚佳[7],本實驗通過觀察溫腎健脾法對 IBS - D 大鼠內(nèi)臟敏感性及曠場實驗的影響,探索溫腎健脾法治療 IBS - D 的療效和作用機(jī)制,為溫腎健脾法在臨床的推廣應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 實驗材料

1. 1. 1 實驗動物 28 只 SD 大鼠乳鼠及 SD 大鼠母鼠購自湖北省實驗動物研究中心。等級: SPF 級,動物批號: 42000600023620,實驗動物使用許可證號:SYXK( 鄂) 2013 - 0069。

1. 1. 2 實驗藥物 番瀉葉,藥物購于中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院; 溫腎健脾方由肉豆蔻 15 g,補(bǔ)骨脂 30g,五味子 9 g,吳茱萸 9 g,黨參 30 g,白術(shù) 15 g,郁金18 g,生姜 10 g,大棗 10 g 組成 。藥物購于中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院。匹維溴銨,購于北京萬生藥業(yè)有限責(zé)任公司,國藥準(zhǔn)字 H20133036。

1. 1. 3 試劑與儀器 球囊導(dǎo)管 ; 曠場實驗箱: 上海欣軟( XR -XZ301) ; YP402N 電子天平 ; AHB - 2 - LB 照相機(jī) 。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 分組與給藥 參照課題組前期造模方法造模 [8]。28 只剛出生乳鼠隨機(jī)分為 4 組,每組 7 只,并與 1 只母鼠同籠飼養(yǎng)。模型組( Model 組) 、溫腎健脾方組( WSJP 組) 及匹維溴銨組( Pinaverium bromide 組) 乳鼠于出生后第 2 天 ~ 第 21 天每天上午9: 00 - 12: 00 與母鼠分離 3 h,正常組( Normal 組) 不予干預(yù)。第 22 天斷奶,予常規(guī)自由飲食。第 30 天起模型組、溫腎健脾方組及匹維溴銨組以 1. 0 g /ml番瀉葉水煎液灌胃( 10 ml / kg) ,1 次/ d。同時溫腎健脾 方 組 將 中 藥 定 量 加 水 400 ml,煎 煮 濃 縮 至200 ml,按 10 ml / kg 灌胃給藥,2 次/ d( 大鼠用藥劑量= 人體用藥劑量 × KB/KA,KB = 0. 71,KA = 0. 11) 。匹維 溴 銨 片 碾 碎 后 溶 于 蒸 餾 水 配 制 成 濃 度 為1. 5 mg /ml混懸液,按15 mg /( kg·d) 劑量灌胃給藥,2 次/ d( 即匹維溴銨組灌胃劑量為30 mg/( kg·d) 。正常組、模型組以相同體積生理鹽水灌胃,連續(xù) 4 周。

1. 2. 2 觀察指標(biāo)

1. 2. 2. 1 一般情況 觀察大鼠的精神狀態(tài)、體質(zhì)量、活動情況、毛發(fā)光澤度、食欲、大便性狀等。

1. 2. 2. 2 腹壁撤退反射 造模后大鼠在實驗前24 h禁食不禁水,輕觸其肛門部位使其排盡大便。

在大鼠輕度麻醉狀態(tài)下從肛門緩慢插入未充氣且涂石蠟油的后帶球囊的導(dǎo)管,球囊末端距肛門約1 cm,在肛門外1 cm 處將其固定在大鼠尾根部。每只大鼠給予球囊擴(kuò)張 3 次,容量分別為 1. 0、1. 5、2. 0 ml,每次擴(kuò)張持續(xù) 30 s。每次 4 min,每只重復(fù) 3 次,每組 7 只大鼠 AWR 評分( 表 1) 取平均值進(jìn)行統(tǒng)計分析。

 

1. 2. 2. 3 曠場實驗 曠場實驗( 上海欣軟 XR -XZ301) 所用實驗箱為高 30 ~ 40 cm,底邊長為 100

cm 的曠場,周壁的顏色為黑色,曠場底面被平均分為 25 個 4 cm × 4 cm 的小方格。正上方架攝像頭,

視野覆蓋整個曠場。將大鼠放置在正中央格,同時進(jìn)行攝像和計時,時間為 5 min。通過計算機(jī)示蹤分

析系統(tǒng)來分析大鼠在一定時間內(nèi)的活動狀態(tài)。實驗室要保持安靜,室溫為 20 ℃ 左右,光線充足。觀

察指標(biāo): 方格間穿行次數(shù)( 動物的四肢從一個格進(jìn)入另一個格為穿行一次) 、直立次數(shù)( 動物雙前肢同

時離地,或者雙前肢放在墻壁尚算作直立一次) 、中央格停留時間、穿越中央格的次數(shù)。

1. 3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用 SPSS16. 0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,所有數(shù)據(jù)以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差( x ± s) 表示,不同組間兩兩比較

采用單因素方差分析( One - way ANOVA) 中 LSD 法( 小顯著性法) ,P < 0. 05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 各組大鼠一般狀態(tài)觀察

正常組: 大鼠精神狀態(tài)良好,活動性積極,糞便呈顆粒狀。毛發(fā)色白、光澤度良好。進(jìn)食及飲水量

正常。模型組: 大鼠精神狀態(tài)萎靡,活動積極性明顯減弱,出現(xiàn)困乏狀態(tài)。糞便稀薄不成形。毛發(fā)色

澤略微發(fā)黃,缺少光澤度。飲水量增加而進(jìn)食量減少。溫腎健脾方組: 大鼠精神狀態(tài)有一定程度的恢

復(fù),活動積極性提高。糞便在治療 1 周結(jié)束后由稀薄不成形轉(zhuǎn)為半干型及顆粒狀。毛發(fā)光澤度和進(jìn)

食量有所提高。匹維溴銨組: 大鼠精神狀態(tài)有一定程度的恢復(fù),困乏現(xiàn)象基本消失,活動積極性提高。

糞便在治療 5 天后逐漸轉(zhuǎn)為半干型及顆粒狀。毛發(fā)光澤度和進(jìn)食量有所提高。

2. 2 大鼠體質(zhì)量變化監(jiān)測

隨著時間延長,各組大鼠體質(zhì)量都有一定程度的增加。在同一時間點,模型組相較于正常組的體

質(zhì)量顯著降低; 匹維溴銨組和溫腎健脾方組與模型組比較,大鼠體質(zhì)量顯著增加; 匹維溴銨組與溫腎健脾

方組體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見圖 1。

圖 1 各組大鼠體質(zhì)量變化

2. 2 腹壁撤退反射( AWR 評分)

在擴(kuò)張體積為 1. 0 ml 時,與正常組比較,模型組 AWR 評分顯著升高( P < 0. 01) ; 與模型組比較,

匹維溴銨組 AWR 評分顯著降低( P < 0. 01) ; 與模型組比較,溫腎健脾方組 AWR 評分有所降低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在擴(kuò)張體積為 1. 5 ml 和 2. 0 ml 時,與正常組比較,模型組 AWR 評分顯著升高( P <0. 01) ,與模型組比較,匹維溴銨組和溫腎健脾方組AWR 評分顯著降低( P < 0. 01) 。結(jié)果見圖 2。

2. 3 曠場實驗

與正常組比較,模型組大鼠直立次數(shù)、方格間穿行次數(shù)、穿越中央格次數(shù)、中央格停留時間均顯著降低( P < 0. 01) 。與模型組相比,溫腎健脾方組與匹維溴銨組直立次數(shù)、方格間穿行次數(shù)、穿越中央格次數(shù)、中央格停留時間顯著升高( P < 0. 01) 。匹維溴銨組與溫腎健脾方組直立次數(shù)、方格間穿行次數(shù)、穿越中央格次數(shù)、中央格停留時間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見表 2 和圖 3。

3 討 論

IBS - D 的病因復(fù)雜,發(fā)病機(jī)制尚未*闡明,大量的研究表明早期不良生活事件和精神疾病與IBS 的發(fā)病關(guān)系密切[9 - 10]。本研究造模方法以團(tuán)隊前期研究的造模方法為基礎(chǔ),予番瀉葉灌胃聯(lián)合母嬰分離,即采用物理化學(xué)刺激共同作用的方法制備內(nèi)臟高敏并脾腎陽虛型 IBS - D 大鼠模型[8,11 - 12]。魏瑋教授的溫腎健脾方是在四神丸基礎(chǔ)上加入黨參、白術(shù)、郁金組成,功效為溫補(bǔ)脾腎、澀腸止瀉。前期研究顯示,該方可有效改善 IBS - D 大鼠腹瀉、倦怠蜷臥、飲食減少、體重下降等一般狀況[13],提示其可用于脾腎陽虛型 IBS - D 大鼠模型的藥物反證。目前評價內(nèi)臟高敏模型是否成功的方法主要有腹外斜肌放電和腹壁撤退反射評分。因腹外斜肌放電實驗屬于有創(chuàng)性操作,增加實驗復(fù)雜度,因此腹壁撤退反射評分在動物實驗中的應(yīng)用更為廣泛。腹壁撤退反射評分,是通過觀察受刺激后大鼠的腹肌收縮強(qiáng)度給出評分。本研究采用腹壁撤退反射評分,結(jié)果顯示模型組較正常組 AWR 評分顯著升高,說明模型組大鼠存在內(nèi)臟高敏感。而溫腎健脾方和匹維溴銨治療可以顯著降低 AWR 評分,能夠緩解 IBS - D 大鼠的內(nèi)臟敏感性。

曠場實驗( OFT) 又稱敞箱實驗,是評價實驗動物在新異環(huán)境中自主行為、探究行為與緊張度的一種方法。在大鼠進(jìn)入新環(huán)境后,會經(jīng)歷緊張、興奮、探索、適應(yīng)等心理過程,其活動表現(xiàn)為趨避性,好奇性及探索性的特點[14],因而 OFT 能夠反映大鼠進(jìn)入空曠區(qū)域時的自我情緒,是評價嚙齒類實驗動物運(yùn)動功能和焦慮狀態(tài)的經(jīng)典方法。本研究顯示,模型組大鼠與正常組相比,直立次數(shù)、方格間穿行次數(shù)、穿越中央格次數(shù)、中央格停留時間均顯著降低,說明模型大鼠對新鮮事物的好奇程度降低,精神萎靡,活躍性降低,符合焦慮抑郁樣行為。與模型組相比,溫腎健脾方組與匹維溴銨組直立次數(shù)、方格間穿行次數(shù)、穿越中央格次數(shù)、中央格停留時間顯著升高。匹維溴銨組與溫腎健脾方組直立次數(shù)、方格間穿行次數(shù)、穿越中央格次數(shù)、中央格停留時間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,說明溫腎健脾方和匹維溴銨具有一定的抗焦慮的作用。

IBS - D 屬中醫(yī)“腹痛”“泄瀉”“郁證”等范疇,其發(fā)病與感受外邪、飲食不節(jié)、情志失調(diào)及臟腑虛弱等有關(guān)。魏瑋教授認(rèn)為 IBS - D 病位在腸,主要涉及脾、腎、心、肝等,脾腎陽虛是其主要病機(jī),治療應(yīng)以溫腎健脾為主,創(chuàng)立了四神丸加減化裁而成的溫腎健脾方( 肉豆蔻、補(bǔ)骨脂、五味子、吳茱萸、黨參、白術(shù)、郁金、生姜、大棗等) ,方中補(bǔ)骨脂辛苦性熱而補(bǔ)命門,為壯火益土之要藥; 肉豆蔻溫補(bǔ)脾腎而澀腸止瀉; 吳茱萸暖脾胃而散寒除濕; 五味子性溫而不熱不燥,溫腎固澀; 黨參甘溫補(bǔ)中,補(bǔ)氣升陽,長于止瀉; 白術(shù)甘溫性緩、陽中之陰,可升可降,長于補(bǔ)脾益氣、燥濕利水; 郁金入心治血、體清氣竄,其先上行而微下達(dá),長于行氣解郁、祛瘀止痛。生姜散寒行水、大棗滋養(yǎng)脾胃,共為佐藥。諸藥相合,則溫腎暖脾,清心解郁,復(fù)運(yùn)化而固大腸。臨床應(yīng)用收效明顯,團(tuán)隊前期開展的研究證實溫腎健脾方在免疫、炎癥調(diào)控[15 - 16]等方面均有一定作用。本研究通過腹壁撤退反射、曠場實驗進(jìn)一步證實溫腎健脾方可有效改善腸易激綜合征模型大鼠的內(nèi)臟敏感性及焦慮抑郁樣行為,有關(guān)具體作用機(jī)制仍需要作進(jìn)一步的探索。

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