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目的：

通過實(shí)驗(yàn)研宄，闡明朱砂安神丸對(duì)條件性恐懼大鼠恐懼記憶的影響及作用機(jī) 制。

方法：

第1部分：朱砂安神丸對(duì)條件性恐懼大鼠恐懼記憶的影響

• 朱砂安神丸對(duì)條件性恐懼大鼠恐懼記憶習(xí)得的影響

條件性恐懼模型的復(fù)制：將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、給 藥組，每組10只。給藥組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給予朱砂安神丸混懸液（經(jīng)灌胃途徑給予，

• 81mg/g)，空白對(duì)照組、模型對(duì)照組均給予相同體積的雙蒸水，1次/曰，連續(xù) 7日。在末次給藥后，將模型對(duì)照組、給藥組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物依次放入條件性恐懼刺激 箱內(nèi)，適應(yīng)120秒。在第120秒給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單一頻率聲音信號(hào)(2000Hz，75dB)。 第125秒，在聲音信號(hào)的基礎(chǔ)上給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物持續(xù)5秒的不可逃避的足底電刺激 (0.75mA)。第130秒聲音信號(hào)與電刺激同時(shí)結(jié)束，130?190秒內(nèi)不做任何處理。 第190秒重復(fù)120?190秒過程，連續(xù)20次。空白對(duì)照組僅給予聲音信號(hào)不給予 電刺激，其他操作相同。結(jié)束后讓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在刺激箱內(nèi)停留120秒后再放回飼養(yǎng) 籠。

恐懼記憶習(xí)得測(cè)試：復(fù)制條件性恐懼模型的次日，將各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物依次再放 入刺激箱內(nèi)，適應(yīng)120秒。在第120秒給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單一頻率聲音信號(hào)（2000Hz， 75dB)。第130秒聲音信號(hào)結(jié)束，130?190秒內(nèi)不做任何處理，記錄聲音信號(hào)停 止后60秒內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的值直反應(yīng)時(shí)間。第190秒重復(fù)12CM90秒過程，連續(xù)5 次。結(jié)束后讓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在刺激箱內(nèi)停留120秒后再放回飼養(yǎng)籠。記錄各組實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物的僵直反應(yīng)時(shí)間，以此作為觀測(cè)指標(biāo)探究朱砂安神丸對(duì)條件性恐懼大鼠恐懼記 憶習(xí)得的影響。

• 朱砂安神丸對(duì)條件性恐懼大鼠恐懼記憶消退的影響

按上述“朱砂安神丸對(duì)條件性恐懼大鼠恐懼記憶習(xí)得的影響”實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行

條件性恐懼模型的復(fù)制，在習(xí)得測(cè)試后的第1、3、5、7天，將各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物依 次再放入刺激箱內(nèi)，重復(fù)恐懼記憶習(xí)得測(cè)試的操作，記錄各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的僵直反 應(yīng)時(shí)間，以此作為觀測(cè)指標(biāo)探宂朱砂安神丸對(duì)條件性恐懼大鼠恐懼記憶消退的影 響。

• 朱砂安神丸對(duì)條件性恐懼大鼠自主活動(dòng)的影響

按上述“朱砂安神丸對(duì)條件性恐懼大鼠恐懼記憶習(xí)得的影響”實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行

條件性恐懼模型的復(fù)制，在各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行條件性恐懼模型復(fù)制的次日，將各 組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放入大小鼠開場(chǎng)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)，記錄各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)時(shí)間、運(yùn)動(dòng)距 離，以此探究朱砂安神丸對(duì)條件性恐懼大鼠自主活動(dòng)的影響。

實(shí)驗(yàn)儀器

條件性恐懼實(shí)驗(yàn)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司，型號(hào)XR-XC404-2)， 條件性恐懼刺激箱包含隔音箱和刺激箱，隔音箱為670x650x700mm的斯金納箱, 可接入攝像頭、蜂鳴器、喇叭刺激器等模塊。實(shí)驗(yàn)箱尺寸為300x300x400mm的 亞克力箱，前后壁透明，左右壁黑白相間，箱子底部為(p4mm不銹鋼棒，軸間距 為16mm的不銹鋼棒，可通0?5mA恒定電流；

條件性恐懼實(shí)驗(yàn)分析系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司，型號(hào)：SuperFcs); 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：模型對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物PS幅值變化率顯著高于空白對(duì)照組， LTP出現(xiàn)異常的增強(qiáng)。這種突觸功能可塑性的改變可能與條件性恐懼刺激過程 中，海馬出現(xiàn)應(yīng)激損傷有關(guān)。而給藥組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的PS幅值變化率顯著低于模型 對(duì)照組，與空白對(duì)照組更為接近。說明朱砂安神丸能夠下調(diào)海馬異常增強(qiáng)的LTP 7]C平，從而恢復(fù)了海馬LTP/LTD的正常調(diào)節(jié)。

LTP和LTD的誘導(dǎo)都依賴于NMDA受體，而受體激活后產(chǎn)生的是LTP還 是LTD，與突觸后膜Ca?濃度升高的水平有關(guān)。Ca²⁺濃度迅速的大幅度增加將誘 導(dǎo)LTP而適當(dāng)程度的増加會(huì)誘導(dǎo)LTD。正常情況下NMDA與Glu結(jié)合后將突觸 前膜的電信號(hào)轉(zhuǎn)化成突觸后膜的Ca²⁺信號(hào)，使突觸后膜的Ca²⁺濃度升高，大量 的Ca²M乍為第二信使，可進(jìn)一步激活生化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而改變突觸可塑性，產(chǎn)生 LTP。LTP產(chǎn)生后，突觸后膜的一些信使分子作用于突觸前膜，增強(qiáng)Glu的釋 放，維持LTP。但是，慢性應(yīng)激增加海馬內(nèi)Glu含量，Glu與NMDA受體結(jié)合， 激活NMDA受體門控的Ca²⁺通道，引起Ca²⁺過度內(nèi)流，增強(qiáng)了 LTP, LTD受 到抑制，結(jié)果導(dǎo)致新的記憶不能與已有記憶整合，這可能是恐懼記憶難以消退的 機(jī)制之一。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)確定了朱砂安神丸具有促進(jìn)恐懼記憶消退的作用，其作用 機(jī)理可能是與其保護(hù)海馬神經(jīng)元，增強(qiáng)海馬突觸結(jié)構(gòu)與功能可塑性相關(guān)。對(duì)于朱 砂安神丸是否能夠加強(qiáng)LTD，促進(jìn)新記憶寫入己有記憶框架，需要通過測(cè)定給 藥后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物LTD的情況進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究來驗(yàn)證此假說。對(duì)于朱砂安神丸具體改 變海馬區(qū)哪些相關(guān)蛋白的表達(dá)也有待進(jìn)一步研究證實(shí)。